簡要描述:單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)測定試劑盒測定意義:MDHAR 催化 MDHA 還原生成 AsA,在抗壞血酸氧化還原代謝中具有重要作用。
詳細介紹
品牌 | YLKBIO | CAS | 詳見說明書 |
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分子式 | 詳見說明書 | 純度 | 詳見說明書 |
分子量 | 詳見說明書 | 貨號 | YLK-SH113 |
規(guī)格 | 100管/96樣、50管/48樣 | 供貨周期 | 現(xiàn)貨 |
主要用途 | 科研 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 化工,生物產(chǎn)業(yè) |
測定方法: | 微量法、紫外分光光度法 |
單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)測定試劑盒說明書
微量法100T/96S
注 意:正式測定之前選擇 2-3 個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義:
MDHAR 催化 MDHA 還原生成 AsA,在抗壞血酸氧化還原代謝中具有重要作用。
測定原理:
MDHAR 催化 NADH 還原 MDHA 生成 AsA 和 NAD+,NADH 在 340 nm 有特征吸收峰,但是 NAD+沒有。通過測定 340 nm 光吸收下降速率,來計算出 MDHAR 活性。
實驗中所需儀器及設(shè)備:
研缽、冰、臺式離心機、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96 孔板、可調(diào)式移液槍和雙蒸水
試劑組成和配置:
試劑一:液體 100mL×1 瓶,4℃保存。
試劑二:液體 20mL×1 瓶,室溫保存。
試劑三:粉劑×1 瓶(棕色),4℃保存。臨用前加入 3 mL 蒸餾水充分溶解。
試劑四:粉劑×1 瓶,4℃保存。臨用前加入 2.5 mL 蒸餾水充分溶解。
試劑五:液體 15μL×1 瓶,4℃保存。臨用前加 3 mL 試劑二充分溶解。
粗酶液提取:
1. 組織:按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入 1mL 試劑一)進行冰浴勻漿。8000g,4℃離心 10min,取上清置冰上待測。
2. . 細菌、真菌:按照細胞數(shù)量(104 個):試劑一體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建
議 500 萬細胞加入 1mL 試劑一),冰浴超聲波破碎細胞(功率 300w,超聲 3 秒,間隔 7 秒,總時間 3min);8000g ,4℃離心 20min,取上清液置冰上混勻待測。
3. 血清等液體:直接測定。
MDHAR 測定操作:
1. 分光光度計/酶標儀預(yù)熱 30 min,調(diào)節(jié)波長到 340 nm,蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑二在 25℃水浴鍋中預(yù)熱 30 min。
3.依次在微量石英比色皿/96 孔板中加入 20μL 試劑三、20μL 試劑四、20μL 試劑五和 120μL 試劑二,最后加入 20μL 上清液,迅速混勻后于 340nm 比色,記錄 30s 和 150s 的吸光值 30s
和 150s 的吸光值 A1 和 A2,△A=A1-A2。
MDHAR 活性計算公式:
a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下
(1). 按蛋白濃度計算
MDHAR 活性單位定義:25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1 個酶活單位。 MDHAR (nmol/min /mg prot) = △A÷ε÷d×V 反總×109]÷(Cpr×V 樣)÷T
= 804×△A ÷Cpr
(2). 按樣本質(zhì)量計算
MDHAR 活性單位定義:25℃中每克樣本每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1U。 MDHAR (nmol/min /g 鮮重) = △A÷ε÷d×V 反總×109]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T
= 804×△A ÷W
(3)按細胞數(shù)量計算
MDHAR 活性單位定義:25℃中每 104 個細胞每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1 個酶活單位。
MDHAR (nmol/min/104 cell) = △A÷ε÷d×V 反總×109÷(細胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總)÷T = 804×△A ÷ 細胞數(shù)量
(4)按液體體積計算
MDHAR 活性單位定義:25℃中每毫升液體每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1 個酶活單位。 MDHAR (nmol/min /mL) = △A÷ε÷d×V 反總×109÷V 樣)÷T
= 804×△A
ε:NADH 摩爾消光系數(shù),6220 L/mol/cm;d:比色皿光徑,1cm;V 反總:反應(yīng)體系總體積,0.2mL=2×10-4L;V 樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積,20μL=0.02mL;V 樣總:提取液體積,
1 mL;Cpr:上清液蛋白濃度,mg/mL,蛋白質(zhì)濃度需要另外測定,建議使用本公司蛋白質(zhì)含量 BCA 試劑盒;W :樣品質(zhì)量;T:反應(yīng)時間,2min。
b.使用 96 孔板測定的計算公式如下:
(1). 按蛋白濃度計算
MDHAR 活性單位定義:25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1 個酶活單位。 MDHAR (nmol/min /mg prot) = △A÷ε÷d×V 反總×109]÷(Cpr×V 樣)÷T
= 1608×△A ÷Cpr
(2). 按樣本質(zhì)量計算
MDHAR 活性單位定義:25℃中每克樣本每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1U。 MDHAR (nmol/min /g 鮮重) = △A÷ε÷d×V 反總×109]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T
= 1608×△A ÷W
(3)按細胞數(shù)量計算
MDHAR 活性單位定義:25℃中每 104 個細胞每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1 個酶活單位。 MDHAR (nmol/min/104 cell) = △A÷ε÷d×V 反總×109÷(細胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總)÷T
= 1608×△A ÷ 細胞數(shù)量
(4)按液體體積計算
MDHAR 活性單位定義:25℃中每毫升液體每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1 個酶活單位。 MDHAR (nmol/min /mL) = △A÷ε÷d×V 反總×109÷V 樣)÷T
=1608×△A
ε:NADH 摩爾消光系數(shù),6220 L/mol/cm;d:96 孔板光徑,0.5cm;V 反總:反應(yīng)體系總體積,0.2mL=2×10-4L;V 樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積,20μL=0.02mL;V 樣總:提取液體積,1 mL;Cpr:上清液蛋白濃度,mg/mL,蛋白質(zhì)濃度需要另外測定,建議使用本公司蛋白質(zhì)含量 BCA 試劑盒;W :樣品質(zhì)量;T:反應(yīng)時間,2min。
單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)測定試劑盒注意事項:
臨用前配制的試劑未使用完的 4℃保存,3 天內(nèi)使用完。
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